加水至外筒內，被滅菌物品放入內筒。蓋上滅菌器蓋，擰緊螺旋使之密閉。滅菌器下用煤氣或電爐等加熱，同時打開排氣閥門，排凈其中冷空氣，否則壓力表上所示壓力并非全部是蒸汽壓力，滅菌將不完全。
待冷空氣全部排出后(即水蒸氣從排氣閥中連續排出時)，關閉排氣閥。繼續加熱，待壓力表漸漸升至所需壓力時(一般是101.53 kPa，即15磅/英寸2，溫度為121.3℃)，調解爐火，保持壓力和溫度(注意壓力不要過大，以免發生意外)，維持15~30 min。滅菌時間到達后，停止加熱，待壓力降至零時，慢慢打開排氣閥，排除余氣，開蓋取物。切不可在壓力尚未降低為零時突然打開排氣閥門，以免滅菌器中液體噴出。
干熱滅菌器
將培養皿、吸管、試管等玻璃器材包裝后放入箱內，閉門加熱。當溫度上升至160～170℃時，保持溫度2 h，到達時間后，停止加熱，待溫度自然下降至40℃以下，方可開門取物，否則冷空氣突然進入，易引起玻璃炸裂;且熱空氣外溢，往往會灼傷取物者的皮膚。一般吸管、試管、培養皿、凡士林、液體石蠟等均可用本法滅菌。
